Ontrafeling van de rol van macrofagen in AML om betere behandelmethoden te ontwikkelen.

Het probleem
Patiënten met acute myeloïde leukemie (AML) hebben, ondanks de huidige behandelmethoden, een slechte prognose met overlevingskansen van 10-60%. Ondanks het feit dat de meeste patiënten in remissie zijn na de behandeling krijgt een grote groep patiënten te maken met terugkeer van de ziekte. Dit komt doordat de therapie alleen de delende cellen raakt maar niet de infrequent delende leukemische stamcellen. Om dit probleem aan te kunnen pakken is het van essentieel belang om de moleculaire mechanismen van deze leukemische stamcellen te karakteriseren. 
Gebaseerd op recente ontwikkelingen in ons lab en elders, is het duidelijk geworden dat AML niet alleen bestaat uit de leukemische blasten zelf, maar ook uit omliggende tumor-geassocieerde cellen zoals stromale cellen en verschillende soorten immuuncellen. Hoewel er nog veel onbekend is over de moleculaire mechanismen waarmee deze cellen een impact uitoefenen op de kankercellen, is het al wel duidelijk dat ze een intrinsiek onderdeel vormen van de tumor. In het geval van AML hebben we recentelijk ontdekt dat er zich in het beenmerg – in ieder geval in een subgroep van patiënten – een populatie zogenaamde tumor-ondersteunende M2 macrofagen bevindt. In preliminaire in vitro en in vivo studies hebben we kunnen laten zien dat deze M2 macrofagen leukemiegroei kunnen bevorderen, en dat ze de gevoeligheid voor therapieën verminderen. Het doel van het huidige projectvoorstel is dan ook om de mechanismen in detail in kaart te krijgen waarmee deze M2 macrofagen leukemiegroei bevorderen, om zo tot betere behandelmethoden te kunnen komen.

Hypothese en doel van het onderzoek
Onze preliminaire studies hebben laten zien dat in een subgroep van AML patiënten een populatie M2 macrofagen aanwezig is die gekarakteriseerd wordt door hoge expressie van CD163 en CD206.  Deze eiwitten komen niet op de leukemische blasten zelf tot expressie, maar op de M2 macrofagen. Er is duidelijk verschil tussen patiënten onderling, en met name die patiënten met een hoog aantal van deze cellen hebben een significant slechtere prognose dan patiënten met een laag aantal van deze cellen. Deze slechtere prognostische subgroep wordt ook vaak gekarakteriseerd door de aanwezigheid van FLT3-ITD mutaties. Patiënten waarbij vooral M1-type macrofagen gevonden worden – waarvan verondersteld wordt dat ze juist een remmende werking hebben op de tumor – hebben juist een veel gunstigere prognose.
In in vitro en in vivo studies hebben we kunnen laten zien dat deze cellen inderdaad een relevante invloed hebben op de groei van leukemiecellen. Terwijl de aanwezigheid van M1 macrofagen remmend werkte op de groei, zagen we dat de aanwezigheid van M2-type macrofagen de groei verbeterde en de effectiviteit van drugs verminderde. Ook in vivo, wanneer M2-type macrofagen werden geïnjecteerd in het beenmerg van muizen, zagen we dat leukemiegroei versterkt werd. Zelfs wanneer we leukemiecellen 2 dagen in vitro in co-culture brengen met deze M2-type macrofagen, zien we dat de in vivo leukemieontwikkeling sterk verbetert wanneer deze ‘getrainde’ cellen in een muis werden getransplanteerd. Onze hypothese is dat via gesecreteerde factoren, maar ook via direct contact met M2 macrofagen,  de engraftment van leukemiecellen in muizen en leukemiegroei sterk verbetert. De onderliggende mechanismen zijn vooralsnog onduidelijk, en zullen in dit projectvoorstel onderzocht worden.

Plan van aanpak
WP1: Ten eerste zullen we M2-type en M1-type macrofagen isoleren van 20 AML patiënten. Deze cellen zullen worden gekarakteriseerd op verschillende niveaus, en o.a. hun genoom, transcriptoom en metaboloom zullen in kaart gebracht worden.  We zullen in detail bestuderen hoe deze cellen leukemiegroei kunnen ondersteunen in verschillende in vitro en in vivo experimenten. Hiervoor zullen we onze humane scaffold muizen gebruiken waarin we een humane micro-omgeving kunnen creëren in de immuun deficiënte muis. Op deze scaffolds zullen we mesenchymale cellen plaatsen die vervolgens zullen zorgen voor botvorming en verschillende stromale celtypen, en daarnaast zullen scafffolds uitgerust worden met M1 of M2-type macrofagen.

WP2: In WP2 zullen we de moleculaire mechanismen proberen te ontrafelen waarmee – na 2 dagen blootstelling aan M2-type macrofagen – leukemische cellen beter zijn uitgerust om te kunnen engraften in getransplanteerde muizen. We zullen het transcriptoom en epigenoom van de blasten voor en na ’training’ op M2-type macrofagen bestuderen. We hebben sterke vermoedens dat ook via cel-cel contact eiwitten uitgewisseld worden tussen M2-macrofagen en leukemische blasten, en dat zal onderzocht worden met behulp van proteoom analyses waarbij de membraaneiwitten van M2-macrofagen gelabeled worden waarna uitwisseling met blasten zal worden bestudeerd. Uiteindelijk zullen we ook time-lapse confocale microscopie doen om in levende cellen de interacties tussen M2-macrofagen en leukemische blasten te bestuderen.

WP3: In onze preliminaire studies hebben we een nieuwe set van 7 M2-macrofaag biomarkers gedefinieerd en in het derde onderdeel van deze grant gaan we kijken in een prospectieve studie of deze set van biomarkers inderdaad in staat is om die patiënten te identificeren die de meest ongunstigste prognose hebben. Dit zal vergeleken worden met de huidige gebruikte biomarkers. Verder zal bestudeerd worden of door middel van het interfereren met de interacties tussen M2-macrofagen en leukemische blasten de leukemieontwikkeling kan worden tegengegaan.  

Verwachte uitkomsten
Na het voltooien van de hier voorgestelde studies zullen we een gedetailleerd inzicht hebben verkregen in de wisselwerking tussen M2-type macrofagen en de leukemieontwikkeling. We zullen inzicht hebben gekregen in de moleculaire mechanismen die hieraan ten grondslag liggen, en we zullen een start hebben gemaakt met het functioneel karakteriseren van deze interacties. We zullen een nieuwe set biomarkers hebben getest waarmee we hopen patiënten met de meeste ongunstigste prognose te kunnen identificeren. Tenslotte hopen we nieuwe aanknopingspunten gevonden te hebben op basis van onze nieuwe inzichten over de interacties tussen M2-type macrofagen en leukemiecellen om betere behandelstrategieën te kunnen gaan ontwikkelen.