Ontrafeling van de moleculaire rol van USP7 in AML en analyse van de potentie van USP7 inhibitie bij AML behandeling

Patiënten met acute myeloïde leukemie (AML) hebben, ondanks de huidige behandelmethoden, een slechte prognose met overlevingskansen van 10-60%. Vooral patiënten met complexe chromosoomafwijkingen en p53 mutaties hebben een extreem lage overlevingskans Ondanks het feit dat de meeste patiënten in remissie zijn na de behandeling krijgt een grote groep patiënten te maken met terugkeer van de ziekte. Dit komt doordat de therapie alleen de delende cellen raakt maar niet de infrequent delende leukemische stamcellen. Om dit probleem aan te kunnen pakken is het van essentieel belang om de moleculaire processen in deze leukemische stamcellen te karakteriseren. Een van de specifieke processen die vaak verstoord zijn in AML is epigenetische regulatie van genexpressie. Door veranderingen in deze epigenetische regulatie in leukemische stamcellen beter te bestuderen hopen we nieuwe therapeutische strategieën te kunnen ontwikkelen die beter aangrijpen op leukemische stamcellen.

Ons laboratorium heeft in de afgelopen jaren veel tijd besteed aan het bestuderen van epigenetische regulatie in normale bloedvormende (hematopoietische) stamcellen en leukemische stamcellen. Dit werk heeft ertoe geleid dat we het epigenetische eiwitcomplex PRC1.1 hebben geïdentificeerd als een complex dat essentieel is voor leukemische stamcellen. Dit complex bindt chromatine door middel van de KDM2B subunit. KDM2B bindt aan niet gemethyleerde CpG eilanden bij target genen. Recentelijk hebben we de interactiepartners van KDM2B uitgebreid in kaart gebracht, wat leidde tot nieuwe inzichten in de functionaliteit van PRC1.1. Een belangrijke vondst was de identificatie van USP7 als belangrijk onderdeel is van het PRC1.1 complex. USP7 is een deubiquitinase, en remming van de enzymatische activiteit van USP7 met behulp van specifieke inhibitors resulteerde in een sterk verminderde stabiliteit en chromatine binding van het PRC1.1 complex. Deze data suggereert dat USP7 inhibitie een uitstekende manier kan zijn om leukemische stamcellen te verwijderen. Dat blijkt ook uit onze in vitro experimenten die laten zien dat primaire patiënten CD34+ AML cellen over het algemeen zeer gevoelig zijn voor USP7 inhibitie. We groeien deze cellen in een 96-wellsplaat systeem wat semi-automatisch geanalyseerd wordt. Dit biedt de mogelijkheid om grotere aantallen patiënten samples te testen onder veel verschillende condities. USP7 is betrokken bij meerdere moleculaire processen, waaronder de regulatie van p53 stabiliteit. USP7 remming in AML patiënten cellen met een mutatie in p53 leidt echter ook tot een sterk verminderde groei. Dit suggereert dat de effecten van USP7 inhibitie niet alleen p53 afhankelijk zijn.

Binnen dit onderzoeksvoorstel willen we (1) met behulp van een in vitro screen in primaire AML patiënten cellen, en in vivo met behulp van muismodellen, de sensitiviteit van AML cellen voor USP7 inhibitie bestuderen. Met behulp van deze informatie hopen we patiënten te kunnen identificeren die gevoelig/ongevoelig zijn voor USP7 inhibitie. Deze data zal verder worden vergeleken met de moleculaire karakteristieken van deze patiënten (bijv. p53 mutaties) en specifieke genexpressie programma’s. Samen met de mechanistische studies in dit onderzoeksvoorstel kunnen we straks een uitspraak doen over de moleculaire routes die ten grondslag liggen aan de gevoeligheid van AML cellen voor USP7 inhibitie. Identificatie van additionele zwakke plekken van AML cellen kan de effectiviteit van USP7 inhibitie verder verhogen, maar stelt ons ook in staat om alternatieve therapeutische strategieën te ontwikkelen in het geval van USP7 inhibitor resistentie. Binnen de 3 onderdelen van dit onderzoeksvoorstel zullen de volgende onderwerpen aan bod komen.

Als eerste zullen we een uitgebreide drug screen uitvoeren met onze specifieke USP7 inhibitor in een panel van minimaal 50 primaire AML patiënten samples die representatief zijn voor verschillende moleculaire subgroepen. Daarnaast zullen we ook een aantal gezonde gemobiliseerde perifeer bloed stamcel (mPBSC) samples analyseren om het therapeutisch raam van USP7 inhibitie duidelijker in kaart te brengen. Deze gezonde bloed stamcel samples zullen gekozen worden op basis van leeftijd van donor, die moet overeenkomen met de leeftijd van de AML patiënten waarvan we samples testen. Deze screen zal worden uitgevoerd in een recentelijk ontwikkelt 96-wells format screening systeem waarbij primaire AML cellen in co-culture worden gekweekt op primaire mesenchymale stromale cellen. Analyse van de platen zal semi-geautomatiseerd gebeuren met behulp van MACS-Quant analyse. De sensitiviteit van AML samples zal worden gecorreleerd met bestaande proteoom en transcriptoom data. Dit zal ons in staat stellen om specifieke signaturen te identificeren die correleren met (in)sensitiviteit (WP1.1).

Vervolgens zullen we met een select aantal primaire AML patiënten samples en mPBSC samples testen op USP7 inhibitor gevoeligheid in een preklinisch in vivo screening model. We maken hierbij gebruik van een gehumaniseerd niche xenotransplantatie muismodel. Vervolgens zullen we het effect van USP7 inhibitie op het ontstaan van leukemie in muis in kaart brengen. Om specifiek de effecten van USP7 inhibitie op leukemische stamcellen in kaart te brengen zullen we secundaire xenotransplantatie muismodellen gebruiken (WP1.2 en WP1.3)

In WP2 bestuderen we de moleculaire routes waarop USP7 direct effect heeft. Daarvoor zullen we de interactiepartners van USP7 in kaart brengen (WP2.1) en analyseren hoe het ubiquitinoom veranderd na USP7 inhibitie (WP2.2). Deze data zal worden gevalideerd met behulp van USP7 knock-out modellen (USP7 auxine-geïnduceerde degron tagging, induceerbare Crispr/Cas9 USP knock-out, en mutant USP7 knock-in.

Als laatste zullen we specifiek analyseren hoe USP7 inhibitie-gemedieerde PRC1.1 remming leukemische stamcellen beïnvloed. We zullen onderzoeken hoe het epigenetische landschap (ChIP-seq), chromatine accessibiliteit (Fast-ATAC) en het transcriptoom (RNA-seq) veranderden als gevolg van het verlies van PRC1.1 in gezonde hematopoietische stamcellen en in leukemische stamcelen in primaire AML patiënten samples. Deze resultaten zullen gevalideerd worden met KDM2B auxine-geïnduceerde degron modellen en induceerbare Crispr/Cas9 knock-outs.

Aan het eind van dit project zullen we:

• de in vitro effectiviteit van USP7 inhibitie op primaire CD34+ AML patiënten cellen in kaart hebben gebracht en het therapeutisch raam bepaald hebben;
• het effect van USP7 inhibitie bestudeerd hebben in vivo met behulp van preklinische gehumaniseerde niche xenotransplantatie muismodellen;
• de moleculaire routes geïdentificeerd hebben die direct gecontroleerd worden door USP7 in AML cellen (interactiepartners/ubiquitinoom);
• kennis hebben van de effecten van USP7 inhibitie-gemedieerde PRC1.1 remming op het epigenoom, chromatine accessibiliteit en het transcriptoom;
• nieuwe therapeutische targets hebben geïdentificeerd die de effectiviteit van USP7 inhibitors op AML cellen verhogen of als alternatieve strategie dienen in het geval van eventuele resistentie tegen USP7 inhibitie.