Menselijke genen die kritisch betrokken zijn bij de bescherming tegen metabolisch geïnduceerde oxidatieve stress.

Inleiding / probleem.

De nu bekende 22 eiwitten van het zogenaamde FA/BRCA-netwerk werken samen in een complex genoomonderhoudsnetwerk, dat betrokken is zowel bij het herstel van ongewenste DNA-DNA-verbindingen als DNA-dubbelstrengsbreuken via een heel precies herstel mechanisme (HDR). Aangeboren monoallelische mutaties in of het BRCA1 of het BRCA2 gen verhogen het risico op borstkanker zeer sterk, terwijl biallelische mutaties het kanker-predispositie syndroom Fanconi-anemie (FA) veroorzaken. Dus dit FA/BRCA network is duidelijk heel belangrijk voor een goed onderhoud van de cel.
De gevoeligheid van FA-cellen voor hyperoxie en andere oxidatieve stressors en ook alcohol (of belangrijke derivaten ervan aceetaldehyde en formaldehyde) wijst erop dat het metabolisme van zuurstof afkomstig uit de atmosfeer (O2) en van alcohol belangrijk is in de pathologie van FA, en naar verluidt het ontstaan van de kanker en andere degeneratieve processen aanstuurt.
Helaas is er echter momenteel geen enkele effectieve behandeling voor FA-tumoren, omdat alle lichaamscellen gevoelig zijn voor de huidige behandelingsmodaliteiten. Juist voor deze patiënten groep zijn dus preventie strategieën heel belangrijk, maar deze zijn er, jammer genoeg niet, behalve dan het vermijden van de consumptie van alcoholische dranken en roken. Daarom zijn er heel dringend nieuwe veilige preventiestrategieën nodig.
Interfereren met deze oxidatieve stress in de FA cellen zou mogelijk de degeneratieve processen tegen kunnen gaan, en daarmee de FA cellen gezonder en sterker kan maken. De kennis over genen betrokken bij zuurstof tolerantie in humane cellen is echter nog zeer beperkt. En dit geldt nog meer, voor de interactie van FA- gerelateerde defecten en zuurstof-stress-gerelateerde genen. Daarom zijn interventies, waaronder het eventuele gebruik van antioxidanten, nu nog niet goed onderbouwd. Kennis over dit soort verdedigings mechanismen tegen schadelijke zuurstof moleculen is natuurlijk ook belangrijk in een breder verband.

Oplossing/onderzoeksrichting.

Een nieuwe benadering in kankeronderzoek: hyperoxie functionele genomica. Voor dit onderzoek is het belangrijk om te starten met zuurstof zelf. De giftigheid van zuurstof uit de lucht begint namelijk met zijn eenwaardige reductie tot het superoxide-anionradicaal (O2-.) in de cel. Superoxide wordt vervolgens metabolisch omgezet in waterstofperoxide door superoxide-dismutasen. Hyperoxie kan op zijn beurt (gedeeltelijk) worden nagebootst door paraquat, waarvan bekend is dat het in staat is om via 'redoxcycli' intracellulaire fluxen van superoxide-radicalen te genereren. Daarom kunnen deze middelen (hyperoxie en paraquat) worden gebruikt om kritische informatie te verkrijgen over de cellulaire beschermingsmechanismen tegen intracellulair gegenereerde zuurstofradicalen. Tot nu toe zijn deze middelen echter zeer weinig in kanker onderzoek gebruikt.
Tot voor kort was verder de identificatie van relevante genetische netwerken grotendeels beperkt tot modelorganismen die geschikt zijn voor klassieke genetische analyse, zoals de gist S. cerevisiae. Studies met dit laatste organisme hebben wel al aangetoond dat genen die betrokken zijn bij tolerantie tegen hyperoxie, ook de levensduur kunnen beïnvloeden. Met de vorderingen die mogelijk zijn gemaakt met de nieuwe genomics technologieën, waaronder de krachtige CRISPR-technologie, is de onbevooroordeelde ontdekking van tolerantiegenen en hun interacties met andere genen nu ook echter binnen bereik gekomen in hogere eukaryoten. Deze nieuwe benaderingen in combinatie met in-vitro-evolutiebenaderingen, waarbij cellen gedurende een langere periode zijn aangepast aan specifieke omstandigheden - ook al gepionierd in de lagere eukaryote modelorganismen - kunnen nu dan worden gebruikt om cruciale genen te vinden.

Hypothese / doel.

We hebben de hypothese dat het mogelijk moet zijn om door middel van nieuwe functionele genoom technieken in combinatie met hyperoxie - op een onbevooroordeelde manier - belangrijke inzichten te verkrijgen over humane zuurstof-stress-gerelateerde genen en hoe deze genen en DNA reparatie genen elkaar beïnvloeden.

Plan van onderzoek.

We stellen voor om twee verschillende typen cel modellen te gebruiken, speciaal gemaakt in ons laboratorium, om meer inzicht te krijgen in de genetische interacties tussen zuurstof-gerelateerde genen en FA genen.
1) In de eerste plaats zullen we gebruik maken van menselijke retinale pigmentepitheel (RPE)-cellen met respectievelijk CRISPR-geïnactiveerde FANCA of FANCC genen. Om gen-gen interacties te identificeren zullen zogenaamde genoom-brede CRISPR Cas9-screens met een hoge complexiteit uitgevoerd worden gebruik makend van de Toronto KnockOut (TKO) v3-bibliotheek bij de normale celkweekconditie van 20% zuurstof, en in de aanwezigheid van een oxidatieve stressor welke geschikt is voor deze heel-grote-schaal experimenten, paraquat. Dit zal een lijst van genen opleveren, welke bij knock-out òf wel mogelijk resistantie, òf meer gevoeligheid geven.
2) Bovendien zullen gegevens uit het publieke domein - met de nadruk op genetische gegevens verkregen via studies van lagere organismen die geschikt zijn voor genetische analyse - worden gebruikt om een ​​op maat gemaakte humane KO CRISPR-bibliotheek te ontwerpen voor kandidaat zuurstofgerelateerde genen. De kleinere omvang van deze op maat gemaakte bibliotheek maakt het mogelijk om nu ook hyperoxie te analyseren. Top-kandidaten van de eerste genoombrede scherm zullen ook één voor één worden geanalyseerd bij de hyperoxie-conditie.
3)  Als een complementaire benadering zullen wij unieke humane FANCC-deficiënte cellen samen met FANCC- gecorrigeerde cellen analyseren, welke in het laboratorium resistent gemaakt zijn tegen oxidatieve stress gedurende een lange periode van meer dan een jaar. Belangrijk is dat met deze laatste methode ook in principe genen kunnen worden geïdentificeerd welke bij overexpressie, tolerantie geven. De analyse van de voorgestelde DNA- en RNA-sequentie experimenten en methylerings experimenten zal ook hier weer kandidaat genen opleveren. Deze genen zullen worden vergeleken met die van de CRISPR screens. Functionele experimenten zullen daarna gebruikt worden om de causale genen te identificeren, zoals ook al eerder succesvol gedaan.
 
Verwachte uitkomst.

Deze studies kunnen een belangrijk nieuw licht werpen op zuurstof tolerantie in humane cellen, en hoe defecten in het FA DNA-reparatie netwerk verband houden met zuurstof-verdedigings mechanismen. Dit zal mogelijk nieuwe ideeën opleveren hoe het FA cellulaire fenotype verbeterd kan worden, en omgekeerd welke omstandigheden juist het FA fenotype verergeren. Daarmee kunnen deze studies dus ook wijzen op belangrijke modificerende genen van het FA cellulaire fenotype, wat potentieel belangrijk is voor de counseling van FA patienten in de klinisch-genetische praktijk. Omdat oxidatieve stress en achteruitgaande DNA reparatie ook gerelateerd zijn aan veroudering en ouderdoms-gerelateerde ziekten, kan de verkregen informatie evident ook relevant zijn in een groter verband. Verder kunnen de experimenten ook een nieuw licht werpen op de biologie van kanker cellen.