Inhibitie van kanker-geassocieerde fibroblasten als behandelstrategie voor invasief lobulair borstkanker

Probleemstelling
Kankercellen hebben intensief contact met normale cellen om hun heen en deze communicatie kan tumorontwikkeling en progressie versnellen. In de afgelopen jaren is gebleken dat therapieën gericht tegen normale cellen in een tumor zeer effectief kunnen zijn. Een normaal celtype wat zich in bijna alle tumoren bevindt is de fibroblast. Deze kanker-geassocieerde fibroblasten (CAFs) beïnvloeden veel verschillende processen zoals tumorgroei, therapierespons en metastase. Daarnaast manipuleren ze immuuncelfuncties zodat de tumor optimaal kan groeien. Het remmen van CAFs is lastig omdat CAFs naast pro-tumorigene functies ook anti-tumorigene functies kunnen uitvoeren. Invasief lobulair carcinoom (ILC) is de op één na meest voorkomende vorm van borstkanker en deze tumoren bevatten bijzonder veel CAFs. Ondanks duidelijke verschillen in histologie, mutaties en uitzaaiingen krijgen ILC patiënten dezelfde behandeling als patiënten met invasief ductaal carcinoom (IDC), de meest voorkomende vorm van borstkanker. Als gevolg hiervan hebben ILC patiënten een slechtere prognose na chemotherapie dan IDC patiënten. Behandelstrategieën toegespitst op de specifieke behoeften van ILC ontbreken. Het doel van dit voorstel is om te onderzoeken of therapie gericht tegen CAFs effectief kan zijn in de behandeling van ILC.

Oplossing/onderzoeksrichting
CAFs zijn de grootste populatie normale cellen in ILC. Een behandeling gefocust op deze cellen kan een zeer effectieve strategie zijn om tumorgroei te remmen. Echter, CAFs zijn een heterogene celpopulatie en hun functies verschillen per tumortype. Analyse van de verschillende soorten CAFs en hun oorsprong is essentieel om te bepalen hoe we pro-tumorigene CAFs veilig kunnen remmen en anti-tumorigene functies behouden.

Door verschillende transplantatietechnieken met borstkanker muismodellen, heb ik ontdekt dat bijna alle CAFs afstammen van normale fibroblasten in de mammaklier. Single-cell genexpressie analyse gedurende tumorontwikkeling laat twee populaties normale fibroblasten zien die differentiëren tot drie CAF populaties. De twee normale fibroblast (NFs) populaties zijn van elkaar te onderscheiden door hun CD26 expressie. De CAF populaties hebben verschillende functies en op basis van genexpressie heb ik CAFs geïdentificeerd met overmatige extracellulaire matrixproductie (ECM-CAFs), CAFs met immuun-modulerende functies (iCAFs) en CAFs met weefselschade-remmende eigenschappen (resolve-CAFs). Computersimulaties suggereren dat iCAFs afkomstig zijn van CD26+ NFs en CD26- NFs bijdragen aan de populatie van ECM-CAFs. Verschillende in vitro experimenten hebben aangetoond dat CD26+ NFs de invasie van tumorcellen versterken. Tevens zijn CD26+ NFs in staat meer monocyten te rekruteren dan CD26- NFs. Deze data suggereert dat de CD26+ NFs aan de oorsprong staan van pro-tumorigene iCAFs.

Om inzicht te krijgen in de communicatie tussen CAFs en tumorcellen heb ik de genexpressie geanalyseerd van FACS-gesorteerde epitheelcellen en fibroblasten uit ILC en controle mammaweefsel. Eiwit-eiwit interactie analyse onthulde een netwerk van CAF-tumor communicatie op basis van ECM-receptor signalering. In vivo verstoringen in deze signalering vertragen tumorvorming.

Met dit onderzoeksvoorstel wil ik meer inzicht krijgen in de transformatie van NFs naar CAFs, de tumor-CAF communicatie valideren in humane weefsels en pro-tumorigene CAFs remmen om de effectiviteit van anti-kankertherapie te verbeteren.

Relevantie
Dit onderzoek sluit aan bij de missie van KWF voor een betere behandeling van kanker. De invasieve groei van ILC maakt het lastig deze tumoren vroeg te detecteren en volledig te verwijderen middels chirurgie. Patiënten worden vaker geconfronteerd met aanvullende behandelingen om hun ziekte te bestrijden. Door pro-tumorigene CAFs in deze tumoren te remmen streef ik naar betere behandelingsstrategieën die zijn afgestemd op de behoefte van ILC patiënten. 

Onderzoeksvragen/doelen
Mijn hypothese is dat CD26+ NFs transformeren tot pro-tumorigene iCAFs en bijdrage aan tumorprogressie. iCAF inhibitie zal leiden tot minder invasie en een sterkere anti-tumor immuun respons.
Binnen dit voorstel streef ik ernaar om:

1. Het verschil in oorsprong van de CAF subpopulaties in vivo te valideren.
2. Het effect van in vivo depletie van CD26+ NFs op tumorontwikkeling en progressie te onderzoeken.
3. De pro-tumorigene functies van CAF te remmen.
4. De CAF populaties en tumor-CAF communicatie zoals ontdekt in de muismodellen te valideren op humane weefsels. 

Onderzoeksopzet
Voor het eerste onderzoeksdoel zal een muismodel gegeneerd worden waarin de CD26- en CD26+ NFs permanent gelabeld zijn met fluorescente eiwitten (GFP en Tomato). Hiermee kunnen we de CD26- en CD26+ NFs volgen tijdens hun transformatie tot CAFs. Genexpressie en functionele analyses van de GFP+ en Tomato+ fibroblasten zullen laten zien of er een predispositie is van CD26- NF om ECM-CAFs te vormen en CD26+ NFs bijdragen aan de iCAF populatie. Daarnaast zullen deze experimenten inzicht geven in de oorsprong van resolve-CAFs.

Voor het tweede onderzoeksdoel zullen we het muismodel zoals hierboven beschreven kruizen met het lox-stop-lox-DTR muismodel. Dit resulteert in difterie toxine receptor (DTR) expressie op de CD26+ NFs. Door deze muizen te behandelen met difterie toxine (DT) kunnen we CD26+ NFs en de CAFs hieruit voortkomend depleteren. Door deze in vivo studies zullen we inzicht krijgen in de bijdrage van CD26+ NFs aan tumorontwikkeling. Tevens zullen deze experimenten ons leren of CD26- NFs functies kunnen overnemen van CD26+ NFs in hun afwezigheid. 

Voor onderzoeksdoel drie zullen de CAF subpopulaties in vitro onderzocht worden om hun bijdrage aan tumor progressie te achterhalen. Middels genetisch verlies en farmacologische inhibitie zal ik de CAF functies remmen. De remmers met de meeste potentie zullen vervolgens in vivo worden getest. iCAF functie zal geremd worden middels Ptx3 en Ccl2/7 remmers aangezien deze eiwitten belangrijk zijn bij de rekrutering van pro-tumorigene immuuncellen. ECM-CAFs zullen geremd worden met SerpinE2 neutraliserende antilichamen. SerpinE2 speelt een belangrijke rol bij ECM productie. Remming van resolve-CAFs is vanuit klinisch oogpunt van onderschikt belang omdat er sterke indicaties zijn dat dit anti-tumorigene CAFs zijn. Alle behandelingen zullen alleen, in combinatie met chemotherapie of targeted therapieën worden getest.

Voor de laatste onderzoeksvraag zal normaal mammaweefsel en ILC-tumorweefsel van patiënten verzamelt worden voor single-cell genexpressie analyse. Deze dataset zal gebruikt worden om onze bevindingen te valideren, overeenkomsten in tumor-CAF communicatie tussen muis en mens te onderzoeken en onze kennis van CAFs in humane ILC te vergroten.

Verwachtte uitkomsten
De voorgestelde experimenten zullen de onderzoeksresultaten bevestigen in humane setting en inzicht geven in de relatieve bijdrage van CD26- en CD26+ NFs aan tumorontwikkeling en progressie van ILC. Vanuit de CAF inhibitie studies zal blijken wat de beste strategie is om pro-tumorigene CAFs te remmen.