Functionele validatie van somatische varianten van onbekende betekenis in klinisch relevante kinasen.

Probleemomschrijving
Genomische profilering van kanker heeft de identificatie van aangrijpingspunten voor doelgerichte therapie mogelijk gemaakt, wat uiteindelijk helpt bij het optimaliseren en personaliseren van behandelstrategieën. Het nauwkeurig koppelen van DNA-fouten in kankergenen aan gerichte antikankermiddelen vereist biologisch begrip van deze genetische afwijkingen. Helaas worden veel genomische veranderingen in kankergenen nog steeds geclassificeerd als varianten van onbekende betekenis (VUS). Vooral VUS die niet tot aminozuurveranderingen leiden, zoals structurele varianten (SV's), zijn tot op heden nauwelijks onderzocht. Dit is van bijzonder belang voor VUS in kankergenen die coderen voor eiwitten die door klinisch goedgekeurde therapieën kunnen worden getarget. Er is dus een grote behoefte aan een systematische en snelle classificatie van VUS om de juiste gepersonaliseerde behandeling te kunnen geven aan de betreffende kankerpatiënten.

Oplossing / onderzoeksrichting
De Hartwig Medical Foundation (HMF) en Foundation Medicine (FMI) gebruiken respectievelijk genoomsequencing (WGS) en gerichte sequencing om klinisch relevante veranderingen in patiënttumoren te identificeren. HMF en FMI hebben grote oncogenomische datasets verzameld die de unieke mogelijkheid bieden om VUS systematisch en volledig te identificeren buiten de missense-mutaties die al grotendeels geannoteerd zijn. Met behulp van deze datasets vonden we terugkerende eiwit-truncerende en mRNA-splicing mutaties in FGFR2, evenals SV's, zoals gedeeltelijke amplificaties en eiwit-truncerende 3'-fusies inclusief structurele herschikkingen met niet-coderende genomische regio's. Al deze veranderingen produceren een C-terminaal getrunceerd FGFR2 eiwit dat bijzonder oncogeen bleek te zijn en bovendien gevoelig voor FGFR-remmers. Dit voorwerk heeft geleid tot nieuwe inzichten in de manier waarop FGFR2 oncogene activiteit verwerft en maakt het daarnaast mogelijk om FGFR2-gerichte therapieën te geven aan kankerpatiënten met eiwit-truncerende FGFR2 mutaties die voorheen niet konden worden geclassificeerd. In navolging van dit paradigma willen we in dit KWF project alle niet-missense VUS in eiwit kinasen functioneel annoteren. Om de klinische vertaling te maximaliseren, zullen we ons concentreren op VUS in 63 kinasen waarvoor remmers (PKI's) beschikbaar zijn die klinisch zijn goedgekeurd of momenteel worden getest in fase-III studies.

Relevantie
Dit project zal bijdragen aan een efficiëntere toepassing van gerichte anti-kanker therapieën doordat we meer oncogene mutaties in klinisch relevante kinasen kunnen identificeren die tot therapie-gevoeligheid leiden. Hierdoor zullen we het aantal VUS in deze kinasen effectief kunnen verminderen. Op deze wijze zal dit project bijdragen aan een betere therapie op maat voor meer kankerpatiënten.
De analyses van de oncogenomische datasets van HMF en FMI zullen naast missense SNV's een groot aantal nieuwe VUS opleveren. We zullen deze VUS functioneel annoteren door middel van systematische in vitro en in vivo validatie. We beogen een snelle klinische implementatie van de resultaten uit ons onderzoek. Daarom zullen we ons richten op de VUS in 63 klinisch relevante kinasen waarvoor remmers beschikbaar zijn die al in de kliniek worden toegepast of momenteel in fase-III studies worden getest. 

Plan van onderzoek
Data mining
We zullen de oncogenomische datasets van HMF (2500+ WGS profielen) en FMI (200.000+ profielen van 324 kankergenen) gebruiken om somatische genomische veranderingen in 63 klinisch relevante kinasen te identificeren en deze te classificeren als bekende (niet-)pathogene mutatie of VUS. Op basis van gepubliceerde data verwachten we dat het merendeel van de missense mutaties in silico kan worden geclassificeerd als pathogeen of niet-pathogeen. De meeste SV's en niet-missense SNV's zullen daarentegen worden geclassificeerd als VUS. We zullen de expressie van VUS verifiëren in genomische datasets die DNA- en RNA-sequentieprofielen bevatten. Daarnaast zullen we beschikbare farmacogenomische datasets gebruiken om te testen of tumorcellijnen met een kinase VUS gevoelig zijn voor overeenkomstige PKI's.

Functionele validatie
We zullen alle relevante VUS die uit bovenstaande in silico analyses rollen functioneel in vitro valideren door ze tot overexpressie te brengen in groeifactor-afhankelijke cellijnen. Deze cellijnen zullen vervolgens worden onderworpen aan uitgroei-experimenten in afwezigheid van groeifactoren. Kinasevarianten die in vitro uitgroei bevorderen zullen worden getest op in vivo tumorigeniciteit door lentivirussen met deze varianten te injecteren in somatische tumormodellen. Omdat het merendeel van de kinase VUS voorkomen in borst- en longkanker zullen met name somatische muismodellen voor deze twee kankertypen worden gebruikt voor de in vivo validatiestudies. Om de gevoeligheid van de resulterende tumoren voor kinaseremmers te testen zullen de tumoren worden gecryopreserveerd en getransplanteerd in syngene immunocompetente muizen die zullen worden behandeld met relevante PKI's. Ook zullen menselijke kankercellijnen met relevante kinase VUS worden gebruikt om deze VUS functioneel te testen.

Verwachte uitkomst
Preliminaire analyse van de oncogenomische dataset van HMF toont aan dat we substantiële aantallen VUS, inclusief truncerende SV's, kunnen identificeren in 61 van de 63 klinisch relevante kinasen waarvoor remmers beschikbaar zijn. In het geval van FGFR2 hebben we de truncerende SV's functioneel kunnen classificeren als pathogeen. Truncerende SV's werden ook herhaaldelijk gevonden in verschillende andere receptor-tyrosinekinase (RTK's) genen. Momenteel worden deze RTK's inclusief FGFR2 alleen geclassificeerd als oncogeen als ze hotspot SNV's bevatten, geamplificeerd zijn of in-frame gefuseerd zijn aan andere genen.
We verwachten dat dit KWF project meer inzicht zal geven in de manieren waarop klinisch relevante kinasen oncogene activiteit kunnen verwerven. Maar bovenal zal dit project de efficiënte toepassing van gerichte anti-kanker therapie verbeteren doordat we meer pathogene mutaties in klinisch relevante kinasen kunnen identificeren waardoor we het aantal VUS in deze kinasen effectief kunnen verminderen. Op deze wijze zal dit project bijdragen aan een betere therapie op maat voor meer kankerpatiënten.

Implementatie
We zullen de resultaten van ons onderzoek delen met moleculaire 'tumor boards' en met clinici die betrokken zijn bij klinische studies voor betere therapie op maat bij kankerpatiënten. Prof. Emile Voest en het klinische onderzoeksteam van het NKI zullen  zorgen voor een snelle patiëntenallocatie volgens onze verfijnde inclusiecriteria via het Drug Rediscovery Protocol (DRUP) (https://www.cpct.nl/drup-drug-rediscovery-protocol-studie). Onze bevindingen zullen ook van direct belang zijn voor de tumor boards van buitenlands kankercentra, zoals CNIJ, en internationale precisie-oncologische studies, zoals de Basket of Baskets (BoB) trial van Cancer Core Europe (https://www.cancercoreeurope.eu/clinical-trials), waaraan het NKI deelneemt. Tenslotte zijn onze bevindingen ook nuttig voor HMF en FMI om hun richtlijnen voor precisiediagnostiek te verfijnen.