Dubbele Minuscule Chromosomen: kleine structuren maar mogelijk een grote zwakte voor kankercellen?
Onderzoekssamenvatting
Achtergrond en probleemstelling
Naast chromosomaal DNA kan er ook circulair DNA aanwezig zijn in cellen variërend in grootte (<1 Kb tot meerdere Mb's). Dit type DNA wordt ook wel extrachromosomaal DNA (ecDNA) genoemd. EcDNA-structuren missen typische chromosomale elementen zoals centromeren en telomeren. Een relatief groot subtype van ecDNA, ook bekend als dubbele minuscule chromosomen (DMs), coderen voor genen en worden vaak gevonden in kanker, waar ze geassocieerd zijn met de amplificatie van oncogenen en therapie resistentie. Daarom is de aanwezigheid van deze structuren van cruciaal belang voor het overleven van de kankercellen die ze hebben. Het vinden van factoren die belangrijk zijn voor de functie en vererving van DMs creëert dus een aantrekkelijke therapeutische strategie die nog niet eerder is onderzocht. De processen en spelers die belangrijk zijn voor de structuur, het onderhoud en de eliminatie van DMs zijn echter grotendeels onbekend.
Onderzoeksrichting/voorgestelde oplossing
Om mogelijke therapieën te kunnen ontwikkelen tegen kankercellen die oncogeen amplificatie hebben via dubbele minuscule chromosomen, is het van belang om de processen te ontrafelen die belangrijk zijn voor het behoud en de functionaliteit van deze structuren.
Doel/Hypothese
We streven ernaar om factoren te vinden die belangrijk zijn voor de overleving van cellen met DMs door zowel kandidaten te testen alsmede screens te doen. We verwachten dat dit project zal resulteren in de identificatie van potentiële nieuwe targets voor antikankertherapie voor tumoren die DMs hebben.
Relevantie
In dit project willen we factoren identificeren die een cruciale rol spelen in de functie en het behoud van DMs. We verwachten dat er onder deze factoren targets of processen zullen zijn die kunnen worden gebruikt bij de behandeling van kankers die DMs bevatten. De uitkomst van dit project zal een belangrijke basis vormen voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën en daarmee zou dit project een bijdrage kunnen leveren aan de missie van KWF om meer kanker te genezen.
Onderzoeksvragen
Met dit onderzoek proberen wij te beantwoorden welke mechanismen belangrijk zijn voor de functionaliteit en vererving van DMs.
Onderzoeksopzet
WP1. Karakterisering van kandidaat mechanismen die betrokken zijn bij de scheiding van dubbele minuscule chromosomen.
A. Labelen van DMs om visualisatie en identificatie van DM-bindingspartners mogelijk te maken
We hebben een systeem ontwikkeld om efficiënt isogene cellijnen met en zonder DMs te genereren door gebruik te maken van medicijnresistentie. We hebben met succes HAP1, HeLa en 293T-cellijnen gegenereerd die DMs hebben met de verwachte resistentiegenen.
We hebben DMs gelabeld met het ANCHOR DNA-labelingsysteem. Door live cell imaging toe te passen zullen we het segregatiepatroon onder normale omstandigheden bepalen door de DMs te visualiseren met een fluorescerend eiwit. Hoeveel DMs worden door elke dochtercel geërfd? 'Liften' DMs mee met normale chromosomen? Hoeveel DMs komen in het cytoplasma terecht?
B. Interfereren met DM-segregatie
Er zijn verschillende kandidaat-factoren die eerder in verband zijn gebracht met DNA-DNA-interacties (BRD4), mitotische DNA-individualisering (KI-67, BAF), decatenatie (topoisomerasen, cohesine, condensine), kinetochoor-onafhankelijke alignment van chromosomen (KID) of met het bij elkaar houden van DNA-uiteinden wanneer deze zijn gebroken (TOPBP1). We zullen een korte lijst met kandidaten genereren (~ 15) en bepalen of en hoe deze factoren een rol spelen bij DM-segregatie door middel van live cell imaging experimenten.
C. Kunnen DMs een cGAS/STING-reactie uitlokken?
Cytoplasmatisch DNA kan een cGAS/STING-afhankelijke immuunrespons opwekken. Om te testen of DMs in het cytoplasma leiden tot de activering van cGAS/STING, zullen we bepalen of het forceren van DMs naar het cytoplasma resulteert in een interferonrespons.
WP2. Zoeken naar zwakheden van cellen met DMs
Om belangrijke processen voor DM-bevattende cellen te identificeren, willen we eerst begrijpen welke genen samen met DMs worden gereguleerd. Dit kunnen genen zijn die worden geactiveerd als reactie op stress geïnduceerd door DMs, maar ook factoren die hoger of lager tot expressie moeten komen om de functie van DMs te garanderen.
Om de achilleshiel van DM-afhankelijke cellen te onthullen, stellen we voor om zowel een screen te doen met verschillende compounds alsmede een CRISPRi screen van het complete genoom in isogene cellijnen met en zonder DMs. Deze screens zullen waarschijnlijk leiden tot de identificatie van factoren die belangrijk zijn voor de segregatie van DMs, maar zullen ook factoren omvatten die een rol spelen bij de replicatie, eliminatie en/of chromatine-organisatie van DMs.
C. Opvolging van screen hits
We zullen de tophits van de screens selecteren en de rol van elke hit karakteriseren door live-cel experimenten uit te voeren van cellen met gelabelde DMs, waarbij de respectieve hit is geremd of wel gedepleteerd. Dit maakt het mogelijk om te zien of, wanneer en hoe DMs uit de cellen worden verwijderd. Bovendien zullen we, om te testen of de expressie van het resistentie gen op de DM geremd wordt, RNA FISH en qRT-PCR uitvoeren. Als de hitlijst erg lang is, zullen we ons eerst concentreren op de hits die ook in WP2a zijn geïdentificeerd als factoren die samen met DM’s gereguleerd worden.
D. Hit validatie
In het laatste deel zullen we onze bevindingen van Deel I en Deel II valideren in cellijnen die afkomstig zijn van patiënten en DMs bevatten. Dit zal de verdere verkenning van onze bevindingen naar klinische toepassingen rechtvaardigen.
Verwachte uitkomst
Alles bij elkaar genomen, door het karakteriseren en identificeren van belangrijke spelers in het gedrag, het onderhoud en de regulatie van kanker-geassocieerde DMs, zullen we eigenschappen van extrachromosomale amplificaties ontdekken die kanker-specifiek zijn en dus kunnen worden benut bij kankertherapie.
Implementatie
Onze bevindingen zullen bijdragen aan het begrijpen van de processen die belangrijk zijn voor DM functie, regulatie en tolerantie. Potentieel zullen hier interessante targets tussen zitten die verder kunnen worden geëxploreerd als potentiële anti-kanker therapieën. In sommige moeilijk te behandelen kankers komen DMs zeer vaak voor, bijvoorbeeld in glioblastoma. Onze bevindingen kunnen verder worden getest als behandeloptie voor dit type kankers. Het gebruik van een compound library biedt de mogelijkheid om patenten aan te vragen op stoffen die specifiek effectief zijn voor de behandeling van DM-bevattende kankercellen.