Cycline-afhankelijke kinases die transcriptie moduleren als geneesmiddeltargets voor borstkanker.

Achtergrond en probleemstelling.

TNBC is een notoir agressieve vorm van borstkanker, die in 15-20% van alle borstkankerpatiënten wordt aangetroffen, maar onevenredig veel borstkankergerelateerde sterfte veroorzaakt. TNBC vormt zes genetisch heterogene subtypes. Patiënten met TNBC zijn nog steeds grotendeels afhankelijk van chemotherapie en hebben een zeer slechte 5-jaarsoverleving. Klinische onderzoeken hebben geprobeerd om therapieën toe te passen die zich richten op ontregelde expressie en/of activiteit van specifieke groeifactor receptoren en intracellulaire kinasen. Tot nog toe is de klinische respons onbevredigend. Dit is gerelateerd aan de grote genetische variabiliteit van TNBC alsook de aanwezigheid van compensatie door andere ontregelde signaalroutes. Daarom blijft TNBC een ziekte die dringend behoefte heeft aan nieuwe effectieve therapeutische mogelijkheden.

Onderzoeksrichting / voorgestelde oplossing.

Er is toenemend experimenteel bewijs dat tumorcellen sterk afhankelijk zijn van bepaalde transcriptionele activiteit. Het identificeren van cruciale therapeutische doelwitten in de tumorcel die de specifieke transcriptionele afhankelijkheid controleren zal bijdragen aan de medische behoefte aan een efficiënte behandeling van kanker. Transcriptionele cycline-afhankelijke kinasen (CDK) behoren tot de grotere familie van CDK eiwitten. Transcriptionele CDKs moduleren de activiteit van genen en de activiteit van specifieke transcriptionele programma's. Nieuwe specifieke farmacologische remmers van verschillende tCDK's openen veelbelovende wegen voor therapeutische interventie bij kanker. Net als in andere vormen van kanker komen tCDKs verhoogd tot expressie in TNBC  en lijken ze van belang voor kankerprogressie. We denken dat tCDKs uitstekende doelwitten zijn voor gerichte behandeling van TNBC.

Onderzoeksvragen.

In ons voorbereidende werk hebben we cellijnen van TNBC gemaakt waarin we op een zeer gecontroleerde manier en zeer efficiënt alle individuele tCDKs kunnen uitschakelen (CDK KO). We hebben daarbij gevonden dat met name CDK9 en CDK12 een cruciale rol spelen voor TNBC cellen. Met behulp van een panel van nieuwe CDK9 en CDK12 remmers hebben we vervolgens waargenomen dat er een verschil is in de gevoeligheid van TNBC cellen voor deze remmers: sommige cellijnen zijn zeer gevoelig, terwijl andere cellijnen resistent zijn. Dit suggereert dat ook tijdens de behandelingen van TNBC patiënten met deze remmers resistentie aanwezig kan zijn. Analyse van genexpressie profielen heeft aangetoond dat specifieke genexpressie programma's worden beïnvloed door deze remmers. Hierbij hebben we gevonden dat zowel verschillende transcriptiefactoren als genen die betrokken zijn bij DNA-herstel neerwaarts werden gereguleerd. Interessant is dat CDK9 KO specifieke genexpressie-signaturen vertoonde die verschillend waren ten opzichte van CDK12 KO, wat wijst op differentiële regulatie van transcriptionele programma's door deze twee tCDKs. Bovendien hebben we met behulp van zogenaamde functional genomics CRISPR-screens verschillende genen geïdentificeerd die betrokken zijn bij resistentie tegen een nieuwe CDK12 remmer, THZ531. Een van deze genen, ABCG2, is verantwoordelijk voor het transport van THZ531 uit de cel. Daarnaast werden drie genen geïdentificeerd, MTHFD1, GART en TYMS, die betrokken zijn bij folaat-gemedieerd 1-koolstof metabolisme. Deze metabole route is van groot belang voor tumorcellen. Dit suggereert dat er mogelijkheden zijn voor gecombineerde gerichte therapeutische strategieën en het overwinnen van resistentie tegen tCDK-remmers. Ons streven is om zowel de verschillen in transcriptionele afhankelijkheid van CDK9 en CDK12 in kaart te brengen, als de mechanismen van tCDK-remmer resistentie te ontrafelen en te begrijpen. Dit zal bijdragen aan optimalisatie van mogelijke toekomstige behandelingen van TNBC met nieuwe tCDK-remmers.

Onderzoeksopzet.

Het doel van het project is om de farmacologische werkzaamheid en het werkingsmechanisme van tCDK remmers vast te stellen, de mechanismen die resistentie tegen tCDK-targeting bepalen, en deze bevindingen te vertalen naar TNBC PDX-modellen en humane TNBC biopten van primaire tumoren alsook TNBC cellen in pleurale effusie biopten.

Het eerste doel van het project is het in kaart brengen van de genexpressie netwerken in  TNBC die afhankelijkheid zijn van tCDKs. Hiervoor zullen we chromatine immuunprecipitatie van CDK9 en CDK12 doen, gevolgd door sequencing. Hiermee zijn we in staat om de genen te identificeren die gevoelig zijn voor remming van CDK9 en CDK12. We zullen deze genen direct relateren aan de genexpressie veranderingen die veroorzaakt worden door remmers van CDK9 en CDK12. Uiteindelijk zullen we expressie van deze genen ook relateren aan klinische data van TNBC  patiënten.

Het tweede doel is om de mechanismen te begrijpen die bepalend zijn voor zowel de gevoeligheid alsook de resistentie van TNBC voor tCDK remmers. Hiervoor zullen we eerst de effecten van remming op de farmacologische respons bepalen in een groep van zowel  gevoelige als resistente TNBC-cellijnen. Daarnaast zullen we ook nieuwe CRISPR screens uitvoeren om genen te identificeren die bepalend zijn voor de resistentie tegen CDK9 en CDK12 remmers. Voor de geïdentificeerde genen zullen we systematisch de rol en mechanismen resistantie tegen tCDK remmers onderzoeken.

Het derde doel is om te bepalen wat de rol is van CDK9 en CDK12 in de in vivo situatie in primaire tumoren alsook metastasen. Bovendien willen we bepalen of TNBC testsystemen die dichter bij de patiënt situatie staan ook gevoelig zijn voor CDK9 en CDK12 remmers. Eerst zullen we de afhankelijkheid van TNBC cellen van CDK9 en CDK12 in de primaire tumor en metastase omgeving bepalen, waarbij we CDK9 of CDK12 gecontroleerd uitschakelen en vervolgens bepalen of er een verschil is in consequenties voor tumorcel overleving in verschillende delen van de primaire tumor, dan wel de locatie van de metastasen. Daarnaast zullen we gebruik maken van een uniek panel van TNBC PDX modellen om de werkzaamheid van zowel de CDK9 als de CDK12 remmers te onderzoeken. Als laatste zullen we de werkzaamheid van de remmers testen in een intacte tumor stukjes van TNBC patiënten en ook in tumorcellen verkregen van pleuravocht van TNBC patiënten.

Onze gecombineerde resultaten zullen inzicht opleveren in de rol van CDK9 en CDK12 in TNBC en de uiteindelijke mogelijke toepassing van remmers van deze genen voor een succesvolle behandeling van TNBC patiënten.