COCOON studie: Modelleren van de dynamische interactie tussen fibroblasten, tumor cellen en de extracellulaire matrix in galwegkanker.

Gerichte Gift
afgerond

Onderzoekssamenvatting

Galwegkanker (cholangiocarcinoma, CCA) is een vorm van leverkanker waarbij de tumor zowel binnen (intrahepatisch, iCCA) als buiten de lever (extrahepatisch) kan ontstaan. In Nederland krijgen jaarlijks ca 400 mensen deze diagnose. Omdat galwegkanker pas laat wordt ontdekt, mede vanwege late en geringe klachten, is curatieve behandeling waaronder chirurgische verwijdering van de tumor, vaak niet meer mogelijk en wordt een palliatieve behandeling met chemotherapie aangeboden. Helaas is dit weinig effectief door ongevoeligheid van de tumor voor de chemotherapie (chemo-resistentie). Deze resistentie wordt mogelijk veroorzaakt doordat de toegang tot de tumorcellen wordt geblokkeerd door omgevingsfactoren (extracellulaire matrix (ECM) eiwitten), de activatie van drug-effluxpompen in de tumorcel en/of de remming van celdood van tumorcellen. Ook zijn kankerstamcellen die aanwezig zijn in de tumor, vaak resistent voor behandeling. Deze stamcellen ontvangen signalen van naburige cellen (fibroblasten), en zorgen zo voor een continue aanvoer van nieuwe tumorcellen.

Probleemstelling

Voor het bestuderen van cholangiocarcinoma, en met name om de reactie op een behandeling of de oorzaak van ongevoeligheid hiervoor te kunnen bestuderen, zijn complexe kweeksystemen nodig. Hoewel nieuwe 3D celkweektechnieken zijn ontwikkeld waarmee, in elk geval voor een deel, de tumor kan worden nagebootst, bevatten deze zogenaamde organoïdkweken nu nog alleen tumorcellen en kunnen hiermee geen interacties met andere cellen of weefselcomponenten worden bestudeerd. De samenstelling van galwegtumoren is echter zeer complex. Naast tumorcellen, zijn er ook stromale celtypen als fibroblasten, endotheelcellen en immuuncellen aanwezig en zorgen en ECM eiwitten voor een zeer dichte en stijve (desmoplastische) omgeving van de tumor. Het is bekend dat deze tumor omgeving een grote rol speelt bij de ontwikkeling, de progressie en metastasering van tumoren, en ook een belangrijke factor is bij de resistentie voor behandeling. Het is daarom van groot belang om deze cellen in kaart te brengen en de interactie met elkaar en met de ECM eiwitten te bestuderen. Hiermee wordt het mogelijk nieuwe behandelingen te ontwikkelen die het afzetten en remodelleren van ECM eiwitten beïnvloeden.

Onderzoeksrichting

In dit project richten we ons op de fibroblasten die betrokken zijn bij het vormen van een dichte massa van ECM eiwitten rondom de galwegtumor. Dit is één van de belangrijkste omgevingsfactoren die verantwoordelijk is voor chemoresistentie. Er zijn verschillende subtypen van deze kanker-geassociëerde fibroblasten (CAFs) aangetoond in galwegtumoren, en elk subtype heeft een eigen pecifieke functie. We gaan met een nieuw ontwikkelde imaging mass cytometry analyse methode, MATISSE genaamd, bestuderen welke CAF subtypen zich waar in de tumor bevinden. Met deze kennis kunnen we vervolgens de CAFs die betrokken zijn bij desmoplasie, de zogenaamde matrix-CAFS (mCAFS), uit tumoren isoleren en gebruiken in een reeds opgezet (eenvoudig) CCA tumor model waarin we CCA organoïden kweken in hun ECM omgeving. Door de mCAFs te kweken in combinatie met de tumor organoïden in de tumor matrix, kunnen we bestuderen hoe de ECM wordt geremodelleerd onder de invloed van CAFs en tumorcellen. 

Onderzoeksopzet

De eerste stap in dit onderzoek is het identificeren van verschillende CAF subtypen in een grote groep iCCA tumoren. Op basis van een reeds bekende genexpressie atlas kunnen we een set van antilichamen (~30) ontwikkelen waarmee we met een geavanceerde 35-kleuren imaging mass cytometry techniek (IMC; MATISSE), de distributie en aantallen van de CAFs zichtbaar maken. Door dit in een groot cohort van patienten te doen, krijgen we meteen ook inzicht in de vermeende heterogeniteit in iCCA tumoren. Als we eenmaal de aantallen en distributie van mCAFs hebben aangetoond, kunnen we deze cellen uit vers verzamelde iCCA tumoren isoleren. In het tweede deel van ons onderzoek, zullen we de mCAFs kweken in een al eerder opgezet tumor model waarin we tumor organoïden in tumor ECM kweken. In dit nieuwe tumormodel zullen we bestuderen hoe CAFs remodelering van ECM beïnvloeden en in welk mate ook de tumorcellen zelf hierdoor worden beïnvloedt. Uitleesssystemen zijn ondermeer gen- en eiwitexpressie van de tumoren en de CAFs, eiwit (met name collageen) productie door de organoiden en de CAFs en microscopie waarmee cell-cell en cell-ECM interacties, maar ook ECM compositie en stijfheid wordt gemeten.

De ECM die gebruikt wordt is afkomstig van biopten die zijn verzameld tijdens chirurgische resectie van galwegtumoren. Deze biopten worden ontdaan van hun cellen door een proces dat decellularisatie heet. Ook de organoïden worden uit galwegtumoren gekweekt en samen met de ECM gekweekt. Met dit (vereenvoudigd) tumor model hebben we al kunnen vaststellen dat de tumorcellen zelf, dus zonder de invloed van stromale cellen zoals CAFs en immuuncellen in de tumor, hun omgeving remodeleren (zie preliminary results). Door CAFs toe te voegen aan dit kweekmodel, kan de interactie tussen de (tumor)cellen en ECM nauwkeurig worden bestudeerd.

Verwachte uitkomsten

Het eerste deel in het onderzoek geeft ons nieuwe, gedetailleerde informatie over hoe een iCCA tumor is samengesteld. Door het CAF landschap in de tumor te bepalen leren we welke typen CAFs er in een tumor aanwezig zijn. Door dit voor 30 of meer tumoren van patïenten met intrahepatische cholangiocarcinoma uit te zoeken, krijgen we tegelijk inzicht in de heterogeniteit van iCCA tumoren. Het nieuwe tumormodel dat in het tweede deel van dit project wordt opgezet, zal informatie geven over de functie van de CAFs, hun rol in het ontstaan van de stijve en dichte ECM massa die de tumor omringt, en de invloed die CAFs en de ECM  hebben op het gedrag van tumorcellen en hun chemo-resistentie. 
Uiteindelijk kan dit nieuwe tumormodel gebruikt worden om mogelijke behandelmethodes bijvoorbeeld specifiek gericht op het afbreken van ECM te testen. Dit is uitermate belangrijk gezien het feit er op dit moment alleen palliatieve behandeling voor CCA mogelijk is en door chemo-resistentie deze patienten een zeer slechte prognose hebben. 

Relevantie

Er is tot nu toe weinig bekend over het ontstaan en progressie van iCCA en welke signalen hierbij belangrijk zijn. Bij gebrek aan alternatieven, is onderzoek naar CCA tot nu toe voornamelijk gedaan met behulp van (artificiële) cellijnen, dierproeven of tumororganoïden waarbij cel-cel interactie is bestudeerd, maar waarbij de tumoromgeving buiten beschouwing wordt gelaten. Door ook de tumoromgeving te betrekken in tumormodellen zal uiteindelijk de ontwikkeling van nieuwe, zogenaamde ECM-targeting behandelingen om iCCA te behandelen binnen bereik zijn.

Resultaten / in de media

Het remmen van het eiwit Bcl-xl kan de gevoeligheid voor het standaardmedicijn gemcitabine herstellen. Dat blijkt uit het onderzoek met patiënt-afgeleide organoïden. In tumoren die eerst resistent waren, leidde Bcl-xl-remming tot meer celdood. Andere eiwitten uit dezelfde familie hadden dit effect niet. De resultaten laten zien dat Bcl-xl een veelbelovend aangrijpingspunt is voor combinatietherapie, zeker bij patiënten die niet reageren op chemotherapie. De gebruikte organoïden vormen bovendien een krachtig model om nieuwe behandelstrategieën te testen.