Het tot stand brengen van MUSIC (mutatie signatuur catalogus) voor DNA dubbelstrengs breuken

Het gemak waarmee tegenwoordig de sequentie van enorme hoeveelheden moleculen DNA kan worden afgelezen, tegen redelijk geringe kosten, is een continue bron van nieuwe technologische ontwikkelingen. Zo is het recent mogelijk om de uitkomst van het herstel van DNA breuken te bestuderen via het verkrijgen van zogenaamde mutatie-signaturen. Deze signaturen kunnen fungeren als “vingerafdrukken” van reparatiemechanismen die in sommige tumorcellen overactief zijn. Een voorbeeld hiervan is de analyse van borsttumormateriaal met Next-Generation Sequencing (NGS) technologie: tumoren met een mutatie in BRCA1 of BRCA2 laten een karakteristiek (verschillend) patroon zien van veelvoorkomende mutaties die accumuleren. Het in kaart brengen van dergelijke mutatieprofielen kan bijzonder nuttig zijn, omdat hiermee behandelingsstrategieën afgestemd kunnen worden (in plaats van bijvoorbeeld de locatie en histologische eigenschappen van de tumor). Ook verschaft het direct inzicht in mogelijke kwetsbaarheden van specifieke tumorcellen omdat het de routes kan identificeren die voor de groei van een tumorcel essentieel zijn geworden. Een basaal begrip van mutatie-signaturen en hun ontstaansgeschiedenis kan dus leiden tot klinische translatie.

Ons lab heeft recent aangetoond dat de genomische variaties die kenmerkend zijn voor BRCA1-inactiviteit het resultaat zijn van een breukherstelmechanisme waarbij het enzym polymerase-theta (POLQ) een essentiële rol vervult. Dit mechanisme leidt zonder uitzondering tot mutaties, en wel met een karakteristiek patroon, namelijk deleties die gekenmerkt worden door micro-homologie op de plek waar de DNA strengen zijn verknoopt, en incidenteel ook zogenaamde “templated” inserties - stukjes DNA die nieuw zijn ontstaan omdat POLQ af en toe een stukje flankerend DNA kopieert voordat de breukuiteinden aan elkaar worden gezet. Het bepalen van mutatie-signaturen biedt dus de mogelijkheid om de activiteit van specifieke breukherstel-mechanismen te monitoren en te herkennen, en dus ook om (nieuwe) componenten van een reparatiemechanisme te ontdekken, bijvoorbeeld door voor ieder eiwit te bepalen of een mutatiesignatuur verandert wanneer het desbetreffende coderende gen wordt uitgeschakeld. 

Het doel van dit voorstel is om voor ieder eiwit dat gecodeerd wordt door ons genoom te bepalen of, en in welke mate, het bijdraagt aan DNA breukherstel, via het verkrijgen van mutatie-profielen van ongekende resolutie. Door een combinatie van NGS en genoomediting (CRISRP/Cas9) technologieën zullen genoom-brede MUtatie SIgnaturen Catalogi (MUSIC) worden gecreëerd, waarbij  de eiwitten zullen worden geïdentificeerd die betrokken zijn dan wel bij het breukherstelproces zelf, dan wel bij het veranderen van de cellulaire omstandigheden die balansverstoringen geven, die met name in tumoren kunnen optreden.

Deze aanpak is gebaseerd op de volgende spitsvondigheid: door de breuken aan te brengen in hetzelfde stuk DNA dat ook gebruikt wordt om genen te inactiveren worden de herstelproducten direct gekoppeld aan het gendefect. Hierbij heeft de sequentie die gebruikt wordt om het gen te inactiveren (het sgRNA) een dubbele functie omdat het ook dienstdoet als een code die aan ieder herstelproduct is verankerd. De haalbaarheid van deze innovatieve aanpak hebben wij aangetoond in voorwerk, waarbij  de experimentele strategie is getoetst door het uitschakelen van een aantal genen met een bekende specifieke rol in DNA breukherstel. Verder hebben wij drie DNA sequenties geïdentificeerd die vanwege de sequentie context ook andersoortige, karakteristieke mutatie-uitkomsten laten zien, waarmee we de mogelijkheid scheppen om nieuwe (mogelijk meer subtiele) biologie omtrent DNA breukherstel te ontdekken. In dit projectvoorstel willen wij nu de experimenten uitvoeren op genoom-brede schaal door ~18.500 genetische achtergronden te bestuderen aan de hand van ~5 sgRNAs per gen, om in totaal ~90.000 mutatie-profielen per breuklocatie te genereren. Door gebruik te maken van door ons eerder ontwikkelde software zullen wij een allesomvattende catalogus opstellen waarin genen geclusterd worden op basis van de impact op de mutatie-signaturen, en dus mogelijk werkzaam zijn in DNA breukherstel-mechanismen, of verstoringen hiervan tegengaan. Tegelijkertijd zullen wij werken aan het implementeren van variaties op de ontwikkelde strategie ten behoeve van additionele biologische vraagstukken omtrent DNA breuken. Zo zullen we MUSIC genereren: in i) humane cellijnen met een bepaalde kankerhistorie, in ii) cellen met een specifiek gendefect, onder andere om genetische interacties te ontdekken, en voor iii) DNA breuken met verschillende configuratie, waarvan bekend is dat hier andersoortige reparatiemechanismen op acteren.